Przed eksperymentem wszystkie odczynniki i próbki należy doprowadzić do temperatury pokojowej; po przetopieniu próbki należy ponownie odwirować i pobrać supernatant do badań; w przypadku odczynników lub przygotowania próbki należy mieszać i unikać pienienia; kalibracja i próbki są zalecane do podwójnego testowania.

1. Dodaj ple: dodaj po kolei standardowy roztwór roboczy do pierwszych dwóch dołków i dodaj dwa otwory dla każdego stężenia roztworu roboczego, 100 μ L każdego dołka. Próbki do badania dodaje się do innych studzienek, 100 μ L na studzienkę (dla stężenia próbki powyżej zakresu testowego, próbka rozcieńczona standardem i rozcieńczeniami próbki). Mikropłytkę powleczono filmem i inkubowano w temperaturze 37°C ℃ przez 90 min. Wskazówka: Podczas dodawania próbki na dno mikropłytki staraj się nie dotykać ścianki otworu, delikatnie potrząśnij i wymieszaj, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków. Dodatkowy czas powinien być kontrolowany w ciągu 10 minut.

2. Biotynylowane przeciwciało/antygen: odrzucić płyn i wytrząsnąć do sucha, bez przemywania. 100 μl roztworu roboczego biotynylowanego przeciwciała/antygenu natychmiast dodano do każdej studzienki, wymieszano, mikropłytkę i powlekano błoną, i inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 godzinę.

3. Mycie: wstrząsnąć płynem w otworze, dodać 350 μl płynu myjącego do każdego dołka, moczyć przez 1-2 minuty, odessać lub strząsnąć płyn z mikropłytki i osuszyć na grubym bibule. Powtórz ten krok mycia płytki 3 razy. Wskazówka: Pralka może być używana tutaj i podczas innych etapów prania. Każdy etap mycia jest niezbędny w eksperymencie.

4. Koniugat enzymu HRP: 100 μ L roztworu roboczego koniugatu enzymu na dołek, zmieszany, pokryty błoną i inkubowany w 37°C ℃ przez 30 minut.

5. Płukanie: wylej płyn ze studzienki i przemyj płytkę 5 razy w taki sam sposób jak w kroku 3.

6. Substrat: dodać 90 μl roztworu substratu (TMB) do każdego dołka, dobrze wymieszać, dodać otoczkę i inkubować w temperaturze 37°C przez około 15 minut. Uwaga: Czas inkubacji należy skrócić lub wydłużyć w zależności od aktualnej sytuacji w zakresie wywoływania koloru, ale nie dłużej niż 30 minut. Można go zakończyć, gdy w standardowym otworze pojawi się wyraźny gradient.

7. Zakończenie: Dodaj 50 μ L roztworu terminującego do każdego dołka w celu zakończenia reakcji. Uwaga: kolejność dodawania roztworu terminującego powinna być taka sama jak kolejność dodawania roztworu substratu.

8. Odczytać: Natychmiast zmierzyć gęstość optyczną (OD) każdej studzienki przy 450 nm za pomocą czytnika mikropłytek. Czytnik mikropłytek należy otworzyć wcześniej, aby ustawić procedurę testową.

9. Po eksperymencie niezużyty odczynnik należy ponownie umieścić w lodówce zgodnie z określoną temperaturą przechowywania do końca okresu przydatności do spożycia.